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ELISA法检测干扰素
发布时间:2011-12-03   点击次数:517次

干扰素(IFN)是一类具有广谱抗病毒活性的蛋白质,仅在同种细胞上发挥作用。根据其来源、理化及生物学性质的不同,可分为IFN-α、IFN-β、IFN-γ3种干扰素。其中,IFN-α主要由白细胞产生,IFN-β由成纤维细胞产生,IFN-γ主要由T细胞在免疫应答中受到抗原或丝裂原活化后分泌产生。3种干扰素中,IFN-α、IFN-β抗病毒作用较强,IFN-丁免疫调节作用较强。目前已可用基因重组技术制备干扰素投入临床使用。干扰素不能直接灭活病毒,其抗病毒作用是由于它能激活细胞内抗病毒蛋白基因,制造抗病毒蛋白,抑制病毒在体内复制。干扰素不仅可抑制已感染细胞内病毒的复制,而且还可使未感染细胞处于抗病毒状态,对中断病毒的细胞间传播有一定作用;但对病毒整合基因可能仅有暂时抑制其mRNA的转录作用,不能清除病毒基因。干扰素的免疫调节作用表现为它是重要的巨噬细胞活化因子(macro-phageactivating factor,MAF),活化的巨噬细胞能杀死病原微生物或杀伤肿瘤细胞。干扰素能增强各种细胞表达MAF分子从而有利于递呈抗原或利于T细胞对靶细胞的识别和杀伤;还能促进T、B细胞的分化,活化NK细胞和中性粒细胞,从而有助于加强免疫应答。由于干扰素不是一种淋巴细胞的生长因子,故常抑制淋巴细胞(特别是B细胞)的增殖。
IFN抗病毒活性的特点如下:①仅仅是抑制作用,IFN消失后病毒将重新复制,因此必须足量反复应用;②有相对的种属特异性,IFN-γ较IFN-α、IFN-β严格;③IFN不直接灭活病毒,而是通过细胞基因组产生另一些蛋白因子来发挥效能,因此不同细胞对IFN的敏感性不同;④不同感染状态的病毒-细胞系统对IFN的敏感性不同,病毒大量复制、引起细胞炎症应答时,IFN易产生效应;对完整细胞中的整合型病毒无作用。
[检测方法] ELISA法
[方法学原理] 抗人IFN抗体包被在微孔反应板上,待测标本和标准品中的IFN会与抗人IFN抗体结合,游离的成分被洗去,同时加入生物素化的抗人IFN抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和素特异结合,抗人IFN抗体与结合在单克隆抗体上的人IFN结合而形成免疫复合物,游离的成分被洗去。加入显色剂,若反应孔中有IFN,HRP会使五色的显色剂呈现蓝色,加终止液变黄色。在波长450nm处测吸光度,IFN浓度与吸光度成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中的IFN浓度。
[标本准备] 静脉血2ml,不抗凝。
[试剂)
1.预包被微孔反应板
2.浓缩酶结合物
3.酶结合物稀释液
4.标准晶和标本稀释液
5.浓缩生物素化抗体
6.TFN标准品
7.浓缩洗涤液
8.显色剂A、B
9.终止液
[仪器] 酶标仪或全自动酶联免疫检测仪。
[检测步骤]
1.在微孔反应板相应孔中分别加入待测样本、不同浓度标准品100ul,再加生物素化抗体工作液50ul。
2.振荡混匀,置20~25℃环境中温育120min。
3.将孔内液体吸干,用洗涤液充分洗涤5次,干燥。
4.除空白孔外,加入酶结合物工作液100u1。
5.振荡混匀,置20~25℃环境中温育30min。
6.将孔内液体吸干,用洗涤液充分洗涤5次,干燥。
7.每孔加入显色剂A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37℃环境中避光显色10min。
8.加入终止液50gl后,轻轻振荡混匀。用酶标仪(450nm波长)测定各孔吸光度,与标准曲线对照,求出IFN值。
[正常参考值] 各实验室可根据检测方法的不同确立正常参考值。
[注意事项]
1.试剂盒从冷藏环境中取出时应在室温环境中平衡30min后方可使用,来用完的微孔条用自封袋密封保存。
2.酶标板洗涤时各孔均需加满洗涤液,防止孔内有游离酶不能洗净。应设定30-60s的洗涤浸泡时间。
3。滴加试剂前应将滴瓶翻转数次,使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直,以使滴量准确。
4.所有样品和废弃物都应按传染源处理。终止液为2mol/L硫酸,使用时应注意安全
5.每批样本应同时做标准曲线。
6.检测剂工作液按说明书临用前配置。
7.若标本OD值在标准曲线测定范围以外,应适当稀释后重测。
[临床意义] IFN水平的改变主要见于自身免疫性疾病;在感染性疾病中,升高见于急性病毒感染,降低见于乙型肝炎病毒携带者、其他慢性病毒性肝炎及AIDS患者。
 

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