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人ELISA试剂盒试验详细来实践
发布时间:2015-05-25   点击次数:440次

    因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面,业已起到了类似封锁剂的作用。并非所有的人ELISA试剂盒固相均需封锁,封锁不当反而会使阴性本底增高。脱脂奶粉也是一种良好的封锁剂,其zui大的特点是价廉,可以高浓度使用(5%)。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液,也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封锁剂使用,但因为奶粉的成份复杂,而且封锁后的载体不易长期保留,因此在试剂盒的制备中较少应用。封锁的手续与包被相类似。一般说来,双抗体夹心法,只要酶标记物是高活性的,操纵时洗涤彻底,不经封锁也可得到满足的结果。封锁是否必要,取决于人ELISA试剂盒模式及详细的实验前提。封锁(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或锡袋中,在低温可保留数月。包被的zui适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化,每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。但在间接法测定中,封锁一般是不可少的。

    1、有的包被原可能不是蛋白,对于生物素和脂类物质或小分子物质大家要事先对其改造再加以包被,我把方法扼要的列出如下:①亲和素生物素:先亲和素先包被载体,加入生物素化的DNA,这种包被方法平均、牢固,已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。②小分子必需依赖和大的蛋白载体偶联后才能固定在固相载体上。包被原的性质很重要,蛋白浓度,是否降解,人ELISA试剂盒这关系到你做出的抗体可不可以被其识别,所以保留抗原很重要,我做重组蛋白时,师兄都严格警告我一定要在冰浴下缓慢融化就是这个道理。③脂类物质:可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精挥发后,让脂质天然干固在固相表面。

   2、应留意以下原理:因为蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的,靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用,这种物理吸附长短特异性的,受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响,大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团,故更易吸附到固相载体表面。包被液的选择,一般选择ph9.6的碳酸盐缓冲液。但有时因为试验的需要,包被原的特殊性也可能采用中性的缓冲溶液来包。详细的试验还要有坚固的理论外也要实践,看一下*可不可以应用到自己试验当中去。常用的包被液除了刚才提到的pH9.6碳酸盐缓冲液,还有pH7.2的磷酸盐缓冲液和pH7-8的Tris-HCL缓冲液等等。

    3、但*选用什么,要依据。常用封锁剂有:0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉,可以高浓度使用(5%-10%);还有一些稀有用到的各种动物血清(主要为了排除相似蛋白干扰)和酪蛋白等等。封锁就是让大量不相关的蛋白质充填这些旷地空闲,从而排斥人ELISA试剂盒后的步骤中干扰物质的再吸附。封锁:继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。

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